Ферменты в рационе жвачных животных

Т. А. Макаллистер1, А. Н. Христов1, К. А. Бошемин1, Л. М. Роуд1, К.-Ц. Чэн2

1 Министерство сельского хозяйства и продовольствия Канады (г. Летбридж, провинция Альберта, Канада T1J 4B1)

2 Университет Британской Колумбии, факультет животноводства (г. Ванкувер, провинция Британская Колумбия, Канада V6T 1Z4)

ВВЕДЕНИЕ

Экзогенные ферменты широко применялись и применяются для удаления из корма антипитательных факторов (АПФ), улучшения переваримости присутствующих в корме питательных веществ, а также повышения активности эндогенных ферментов в организме птицы (Classen et al., 1991; Bedford, 1993). Использование экзогенных ферментов в кормлении жвачных животных изучалось еще в 1960-х гг. (Burroughs et al., 1960; Rovics and Ely, 1962; Rust et al., 1965), однако полученные результаты сильно варьировались, а попытки определить механизм действия этих ферментов так и не были предприняты. Кроме того, производство экзогенных ферментов было в то время дорогостоящим, а потому использование ферментных комплексов в той дозировке, которая позволила бы улучшить продуктивность животных, было не выгодно. Удешевление продуктов ферментации, достигнутое в последнее время, а также появление более активных ферментных комплексов улучшенного действия позволили возобновить изучение того, как экзогенные ферменты влияют на продуктивность жвачных животных (Chen et al., 1995; Beauchemin et al., 1997; McAllister et al., 1998). В некоторых исследованиях даже были попытки определить возможные механизмы действия таких добавок (Judkins and Stobart, 1988; Feng et al., 1996; Hristov et al., 1998a,b; Yang et al., 1998a). Экзогенные ферменты могут оказывать различное воздействие как на микрофлору ЖКТ, так и на общее состояние жвачных животных. Следовательно, существует высокая вероятность того, что физиологические реакции организма на действие экзогенных ферментов зависят от многих факторов.

В данной обзорной статье собраны все полученные на сегодняшний день сведения о влиянии экзогенных ферментов в рационе на продуктивность жвачных животных. Мы рассмотрим возможные механизмы, посредством которых комплексы таких ферментов могут улучшить использование питательных веществ жвачными, а также предложим стратегии, которые в дальнейшем могут улучшить эффективность этих комплексов в кормлении жвачных.

Источники ферментов

Представленные на рынке ферменты для животных кормов исчисляются сотнями, однако все они получены почти исключительно от четырех видов бактерий (Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, и Streptococcus faecium, spp.) и трех видов грибов (Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, и Saccharomyces cerevisiae) (Muirhead, 1996). Кроме того, список источников ферментов вряд ли сильно расширится, если учесть, что Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США еще не одобрило ни одной заявки на включение в список нового ферментообразующего организма (Pendleton, 1996).

Ферменты являются природными биокатализаторами, произведенными живыми клетками для осуществления конкретных биохимических реакций. В составе добавок для кормов жвачных животных ферменты служат катализаторами деструктивных реакций, при которых субстраты (т.е. компоненты корма) перевариваются, расщепляясь до их химических составляющих (напр., до моносахаридов, аминокислот и жирных кислот). В свою очередь, продукты расщепления используются для клеточного роста либо микроорганизмами рубца, либо организмом хозяина.

Для полного переваривания сложных кормов, таких как сено или зерно, без преувеличения требуются сотни ферментов. На рынке ферментные препараты для жвачных известны, в первую очередь, благодаря своей способности разрушать стенки растительных клеток, из-за чего их часто приравнивают к целлюлазам или ксиланазам. Однако ни в одном из этих препаратов не используется только лишь один фермент – в каждом из них неизменно присутствуют и другие (вторичные) ферменты, такие как амилаза, протеаза или пектиназа. Для разрушения одной только целлюлозы и гемицеллюлозы требуется работа нескольких ферментов, и от того, насколько различаются относительная доля и активность каждого из них, зависит эффективность препарата в разрушении клеточных стенок. В зависимости от выбора штамма, питательного субстрата и условий выращивания бактериальной культуры, полученные ферменты даже в пределах одно вида микроорганизмов могут сильно различаться по своему типу и активности (Considine and Coughlan, 1989; Gashe, 1992).

              Наличие нескольких ферментов в составе реализуемых на рынке препаратов является их преимуществом, поскольку один и тот же препарат можно использовать для широкого спектра субстратов. В то же время, эта особенность затрудняет контроль качества и экстраполяцию результатов исследований на другие препараты. Производство ферментных препаратов для кормов жвачных животных, как правило, стандартизировано. Неочищенные экстракты ферментов смешивают, чтобы обеспечить определенный уровень активности одного или двух конкретных ферментов, например, ксиланазы и/или целлюлазы. При этом активность остальных (вторичных) ферментов никак не стандартизируется. Несмотря на то, что наличие нескольких ферментов может существенно повлиять на общую эффективность ферментного препарата, определение их активности проводится редко.

Определение активности ферментов

Активность фермента определяется путем измерения убыли конкретного субстрата или накопления продуктов биохимической реакции, катализируемой ферментом, за определенный промежуток времени. В пищевой отрасли активность ферментов чаще всего определяется по последнему показателю и выражается в количестве продуктов реакции, образованных за единицу времени. Такие измерения проводятся в условиях четко регламентированной температуры, уровня рН, ионной силы раствора, концентрации и типа субстрата, поскольку каждый из этих факторов может повлиять на активность фермента (Headon, 1993). К примеру, относительная активность целлюлазы в составе трех ферментных препаратов различается в зависимости от выбранного для анализа тестового субстрата (целлюлоза, карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) или β-глюкан) (табл. 1). Кроме того, выход редуцирующих сахаров из КМЦ или ксиланов не бывает прямо пропорциональным концентрации ферментов. Соответственно, на активность фермента влияет соотношение фермента и субстрата (рис. 1, Hristov and McAllister, неопубликованные данные). Активность ферментов также можно определить с помощью синтетических субстратов, которые, как правило, состоят из хромофоров, связанных с молекулами, идентичными по химическому составу и структуре натуральному субстрату.

Активность ферментов определяется как выход красящего вещества, т.е. хромофора (Biely et al., 1985). Такие синтетические субстраты обеспечивают однородность измерений активности, но подвергаются критике из-за своей неспособности заместить субстрат необработанных кормов, таких как злаковое зерно или зернофураж. Кроме того, описанные методы определения активности ферментов не отражают состояние ЖКТ животного, где уровень активности фермента и его функциональная стабильность могут, в конечном счете, сыграть самую важную роль. По этим причинам определение активности ферментов традиционными методами плохо отражает потенциальную эффективность фермента в качестве добавки для кормов жвачных.

Исследователи попытались разработать методы биологического анализа, которые смогли бы лучше охарактеризовать ценность какого-либо ферментного препарата для кормления жвачных животных. Такие методы, как правило, предполагают инкубацию ферментов и корма с содержимым рубца in vitro с последующим замером убыли субстратов (напр., злаковое зерно, солома, сено), которые обычно потребляются животными (Forwood et al., 1990; Varel et al., 1993; Hristov et al., 1996b; 1998a). Альтернативным показателем переваримости может служить количество выделенного смешанной культурой газа (Iwaasa et al., 1998), который позволяет быстро сопоставить различные ферментные препараты и дозировки. Применение данных методов дает ценные сведения о том, в какой степени экзогенные ферменты дополняют пищеварительную активность микроорганизмов рубца. Однако экстраполяция полученных этими методами показателей на всех животных ограничена (i) вариативностью микробиального состава инокулята, взятого у разных животных-доноров; (ii) разницей в росте микробиальных популяций в системе in vitro и в рубце; и (iii) количеством фактически накопленных конечных продуктов, меняющих активность ферментов. Кроме того, данные методы анализа не учитывают возможное влияние экзогенных ферментов на биологические показатели, такие как потребление корма, скорость его прохождения или послерубцовое переваривание.

Поскольку вязкость содержимого кишечника тесно взаимосвязана с ростом домашней птицы и конверсией корма, величина вязкости использовалась как показатель биологической ценности экзогенной карбогидразы в кормлении птицы (Sabatier and Fish, 1996). Однако в случае со жвачными животными ценность ферментов определяется сегодня только по результатам дорогостоящих и продолжительных исследований продуктивности мясного или молочного скота, из-за чего сопоставить большое число препаратов просто невозможно. Отсутствие качественного метода биологического определения ценности экзогенных ферментов является, возможно, самым серьезным препятствием для разработки более эффективных ферментных препаратов для кормления жвачных.

Влияние экзогенных ферментов на продуктивность животных

Мясной скот

Первое подтверждение того, что экзогенные ферменты способны улучшить среднесуточный привес и конверсию корма мясного скота, было получено в ходе десяти опытов, проведенных почти 40 лет назад (Burroughs et al., 1960). После того как в корма из размолотых кукурузных початков, овсяного и кукурузного силоса, а также сена люцерны, добавили комплекс амилолитических, протеолитических и целлюлозолитических ферментов (препарат Agrozyme® производства Merck Sharp & Dohme Research Laboratories), привес животных с таким рационом вырос на 6,8–24,0%, а коэффициент конверсии корма – на 6,0–21,2% по сравнению с показателями контрольной группы. В тот же год четыре разных ферментных препарата (Agrozyme®, Zymo-Pabst®, Rhozyme® и Takamine® производства Merck & Company, г. Рауэй, штат Нью-Джерси, США), дополненные диэтилстильбэстролом и добавленные в рацион из сена кукурузы и люцерны, увеличили привес животных в среднем на 14,0% (Nelson and Damon, 1960).

Дальнейшие исследования подтвердили, что добавление ферментов способно улучшить показатели среднесуточного привеса (ССП) и конверсии корма у животных, получающих богатый силосом рацион (Rovics and Ely, 1962). Однако после добавления в рацион ферментов показатели животных на откорме не всегда менялись в лучшую сторону. Согласно данным Leatherwood et al. (1960), фермент грибкового происхождения (Enzyme 19AP® производства Rohm & Hass Co.), смешанный с зерновой добавкой для телят, рацион которых состоял преимущественно из сена люцерны, не привел к увеличению ССП или коэффициента конверсии корма. Два ферментных препарата, состоявшие преимущественно из амилазы и протеазы, также не смогли увеличить ССП животных, получавших рацион из концентратов (80%) и измельченного сена люцерны (20%) (Clark et al., 1961). В ходе одного исследования препарат Agrozyme®, смешанный с кукурузой и добавленный к кукурузному силосу для мясного скота, даже сократил ССП животных на 20,4% (Perry et al., 1960). К такому же результату привели исследования Kercher (1960): ССП сократился после добавления смешанного с кукурузой препарата Zymo-Pabst® в рацион из пропаренного и плющеного ячменя, сена люцерны и кукурузного силоса. Согласно данным Perry et al. (1966), снижение ССП на 18,2% после добавления к кормовым початкам кукурузы препарата Agrozyme® связано с сокращением потребления корма на 6,8%, которое, в свою очередь, обусловлено способностью препарата увеличивать переваримость клетчатки, что показали более ранние исследования метаболизма животных.

Несмотря на то, что эти первые исследования дали ценную информацию о возможной пользе ферментов для животных мясного направления, они так и не ответили на вопрос о влиянии на продуктивность животных таких факторов, как состав рациона, виды и состав ферментов, а также способы их применения. Более поздние исследования посвящены именно этому вопросу. В контролируемых условиях опытов сопоставлялись разные виды кормов (Beauchemin et al., 1995; Beauchemin et al., 1997), дозировки (Beauchemin and Rode, 1996; McAllister et al., 1998; Michal et al., 1996), ферментные препараты (Pritchard et al., 1996) и способы их использования (Beauchemin et al., 1998b; Yang et al., 1998a; Hristov et al., 1998b). Смесь препаратов на основе ксиланазы и целлюлозы (Xylanase B производства Biovance Technologies Inc., г. Омаха, штат Небраска, США), а также целлюлазы (Spezyme CP® производства Genencor, г. Рочестер, штат Нью-Йорк, США), в дозировке от 0,25 до 4,0 л/т увеличила ССП бычков, получавших рацион из прессованного сена люцерны и тимофеевки, на 30% и 36% соответственно, но никак не повлияла на ССП животных, питавшихся ячменным силосом (Beauchemin et al., 1995). При сочетании той же смеси с рационом, состоявшим на 95% из зерна, конверсия корма у животных, получавших ячмень, выросла на 11%, а у животных, получавших кукурузу, осталась без изменений (Beauchemin and Rode, 1996). Однако использование другой смеси препаратов на основе ферментов грибкового происхождения (Cellulase A и Xylanase B производства Finnfeeds International Ltd., г. Мальборо, Великобритания) в дозировке до 5,0 л/т увеличило конечный вес и ССП животных на откорме, получавших люцерновый (Michal et al., 1996; Pritchard et al., 1996) или ячменный силос (McAllister et al., 1998). Добавление ряда функционально-стабильных ферментов к 82,5% кукурузных кормов повысило ССП и конверсию корма у животных на откорме на 10% и 7,5%, соответственно (Weichenthal et al., 1996). Похожие улучшения конверсии корма наблюдались у животных, получавших амилазу вместе с кормами из сорговых культур (Krause et al., 1989; Boyles et al., 1992).

Молочный скот

Влияние экзогенных ферментов на количество молока у молочных коров было впервые исследовано в 1990-х гг. (Chen et al., 1995; Lewis et al., 1995; Stokes and Zheng, 1995), а с недавнего времени начался настоящий исследовательский бум в этой области (Luchini et al., 1997; Nussio et al., 1997; Kung et al., 1998; Yang et al., 1998a,b; Beauchemin et al., 1998a). Как и в случае с мясным скотом, изучение влияния экзогенных ферментов на продуктивность молочного скота дало неоднозначные результаты. Добавление смеси ферментов (Digest M® производства Loveland Industries Inc., г. Грили, штат Колорадо, США) в сорговые корма не улучшило выработку молока у коров гольштинской породы (Chen et al., 1995). Тот же результат был получен при смешивании экзогенных ферментов (Pro-Mote® производства Biovance Technologies Inc.) с рационами на основе ячменя (см. ниже, Beauchemin et al., 1998a). Включение комплекса целлюлазы и ксиланазы (Finnfeeds International Ltd.) в рацион, содержащий от 45% до 50% концентрата, люцернового силоса, сена люцерны или смеси люцернового силоса, сена и кукурузного силоса, тоже не помогло улучшить выработку молока (Nussio et al., 1997; Luchini et al., 1997). Обработка кукурузного силоса в составе 50% кормового концентрата двумя идентичными ферментными препаратами, напротив, увеличила выработку молока на 2,5 кг/д без изменения его состава (Kung, 1996). Исследования показали, что эти ферментные препараты способны увеличить выработку молока у коров, получавших кормовые смеси из сена люцерны и силоса (Stokes and Zheng, 1995; Lewis et al., 1995; Sanchez et al., 1996), но такое увеличение во многом зависит от дозировки препарата (Sanchez et al., 1996). К примеру, согласно исследованиям научного центра в г. Летбридж, при повышении дозировки добавляемых к прессованной люцерне ферментов (препарат Pro-Mote® производства Biovance Technologies Inc.) с 1 г/кг до 2 г/кг выработка молока выросла с 23,7 кг/д (у коров контрольной группы) до 24,6 кг/д и 25,6 кг/д соответственно (табл. 2; Yang et al., 1998a). Результаты применения этого ферментного препарата в начале периода лактации коров были еще более впечатляющими: добавление ферментов в рацион из кукурузного силоса (24%), сена люцерны (15%) и ячменного концентрата (61%) повысило выработку молока на 4 кг/д. Эффективность данного фермента, скорее всего, зависела от способа его применения, так как при нанесении его на конечную кормовую смесь выработка молока оставалась прежней, а при добавлении его в концентрат – заметно увеличивалась (на 4 кг/д) (Beauchemin et al., 1998b).

Ягнята

Как показали исследования 1960-х гг., использование комбинации амилолитических, протеолитических и целлюлозолитических ферментов (Agrozyme® в дозировке 1,5, 3 и 6 г/д), а также сильного протеолитического фермента (Ficin® производства Merck & Company в дозировке 5, 10 и 20 мг/д), не изменили ни конверсию корма, ни ССП у ягнят на откорме с молотой кукурузой и сеном люцерны в рационе (Theurer et al., 1963). Недавно также выяснилось, что фибролитические ферменты (производства Finnfeeds International Inc.) не повышают потребление корма или ССП у ягнят с рационом на основе сена или ячменя (McAllister et al., 1998).

Выводы по результатам экспериментов на животных

Положительное влияние экзогенных ферментов на рост продуктивности мясного и молочного скота было наглядно продемонстрировано в ходе исследований. Однако сведения, которые позволили бы добиться стабильности и увеличить масштаб этих улучшений, по-прежнему отсутствуют. Сопоставление результатов исследований все больше осложняется тем, что эффект многих ферментных препаратов так и не выяснен до конца. Кроме того, несколько исследований показали неэффективность чрезмерного использования ферментов, так как увеличение затрат в связи с более высокой дозировкой не окупается пропорциональным улучшением продуктивности (Beauchemin et al., 1996; McAllister et al., 1998). Таким образом, использование одного ферментного препарата в определенной концентрации не позволяет судить о возможном влиянии разных дозировок и тем более разных препаратов на продуктивность животных. Эффект от препарата также зависит от способа его применения. Так, препарат оказывает разное воздействие при его смешивании с сухими и свежезаготовленными кормовыми культурами и силосом (Feng et al., 1996; Beauchemin et al., 1995), а также при внесении непосредственно в рубец и добавлении в готовый рацион или в отдельный его ингредиент (Lewis et al., 1996; McAllister et al., 1998; Beauchemin et al., 1998b). Очевидным остается лишь одно: на эффективность ферментов в кормлении жвачных животных влияет множество факторов. Таким образом, понимание механизмов действия ферментов, позволяющих улучшить усвоение питательных веществ жвачными, является ключевым условием для получения стабильных положительных результатов от применения ферментов для большого числа кормов и видов животных.

Механизмы действия ферментов

Изначально предполагалось, что экзогенные ферменты меняют усвояемость корма у жвачных, воздействуя на корм до его употребления или улучшая рубцовое и/или послерубцовое переваривание (рис. 2). В реальности эти механизмы действия тесно взаимосвязаны, и воздействие ферментов на корм до его потребления, скорее всего, влияет на рубцовое и послерубцовое переваривание. Воздействие экзогенных ферментов на корм может заключаться как только в выделении растворимых углеводов, так и в комплексном действии – устранении структурных барьеров (рис. 2А), которые ограничивают микробиальное расщепление в рубце. В самом рубце экзогенные ферменты могут воздействовать непосредственно на корм или косвенным образом стимулировать пищеварительную деятельность, действуя совместно с микроорганизмами рубца (рис. 2В). Экзогенные ферменты могут оставаться активными и в нижнем отделе ЖКТ, участвуя в послерубцовом переваривании клетчатки, или косвенно улучшать всасывание питательных веществ в нижнем отделе, снижая вязкость содержимого кишечника (рис. 2С). Кроме того, эти ферменты могут усиливать активность ферментов в помете, что способствует более быстрому разложению отходов (рис. 2D). В конечном итоге, цель использования любых ферментов – улучшить усвояемость корма у жвачных и снизить количество отходов, но механизм действия экзогенных ферментов в организмах жвачных однозначно сложен и еще недостаточно изучен.

Воздействие на корм

Многочисленные публикации подтверждают, что экзогенные ферменты могут провоцировать выделение редуцирующих сахаров в корме до его потребления (Beauchemin and Rode, 1996; Hristov et al., 1996a,b). Тем не менее активность выделения сахаров зависит и от типа корма, и от типа ферментов. Например, только два из одиннадцати протестированных ферментных препарата способствовали выделению значительного количества редуцирующих сахаров в ячменном силосе (Hristov et al., 1996a). Кроме того, наиболее эффективное выделение редуцирующих сахаров в люцерновом сене и в ячменном силосе обеспечили разные препараты. Некоторые исследования показывают, что экзогенные ферменты могут быть более действенным в сухих кормах по сравнению с влажными (Feng et al., 1996; Beauchemin et al., 1998b). Сначала это кажется невозможным, особенно учитывая фундаментальный биохимический принцип о неотъемлемой роли воды в гидролизе растворимых сахаров из сложных полимерных соединений (Lehninger, 1982). Однако для кормления жвачных редко используется абсолютно сухой корм; даже в кормах, которые считаются «сухими» (например, зерно, сено), содержание влаги составляет 6–10%. Выделение растворимых сахаров в таких кормах говорит о том, что они содержат достаточное для гидролиза количество влаги.

Выделение сахаров в кормах происходит частично за счет повышения растворимости нейтрально-детергентной и кислотно-детергентной клетчатки (НДК и КДК) (Hristov et al., 1996a; Gwayumba and Christensen, 1997). Эти данные согласуются с наблюдаемым ростом количества растворимой фракции и скоростью переваривания in situ (Feng et al., 1996; Hristov et al., 1996a; Dong, 1998; Hristov et al., 1998a; Yang et al., 1998a). Однако большинство исследований не смогли выявить экзогенные ферменты, способные улучшить степень переваримости сухого вещества in vitro или in situ (Feng et al., 1996; Hristov et al., 1996a). Таким образом можно предположить, что ферментные добавки только обеспечивают разложение субстрата, который переварился бы естественным образом при помощи эндогенных ферментов микрофлоры рубца. В ходе исследования посредством сканирующей электронной микроскопии было установлено, что высокая концентрация фибринолитических ферментов может вызвать разрушение клеточных стенок ячменной соломы (рис. 3). Однако подобное нарушение не наблюдалось, если ферменты применялись в рекомендованной производителем концентрации (McAllister et al., неопубликованные данные).

Несмотря на то, что экзогенные ферменты действительно активизируют выделение растворимых углеводов, их количество составляет лишь небольшую часть от общего содержания углеводов в рационе. Не стоит связывать наблюдаемое влияние ферментов на продуктивность животных только с образованием растворимых углеводов в корме до его употребления, поскольку аналогичное увеличение продуктивности отсутствовало, если до 9% общего количества сухого вещества поступало в виде патоки (Wing et al., 1988). Кроме того, существуют многочисленные подтверждения того, что в конечном итоге растворимые углеводы могут ухудшить переваривание клетчатки у жвачных (Huhtanen, 1991). Некоторые препараты с экзогенными ферментами содержат растворимые углеводы, которые при исследовании in vitro снижают выделение газов (Varel et al., 1993), однако маловероятно, что при практическом применении такие препараты смогли бы значительно повысить количество растворимых углеводов в корме. Таким образом, по всей видимости, повышение продуктивности животных, получавших ферментные добавки, объясняется не только воздействием ферментов на корм, но и их внутрирубцовым и послерубцовым действием.

Внутрирубцовое действие

Прямой гидролиз: До недавнего времени считалось, что при попадании в рубец экзогенные ферменты быстро разрушаются под влиянием протеазы, продуцируемой микроорганизмами рубца (Kung, 1996). И действительно, грибковая целлюлаза, инкубированная в рубцовой жидкости, распадалась достаточно быстро: через 6 часов осталось всего 25% активных ферментов (Kopency et al., 1987; Vandevoorde and Verstraete, 1987). Исследования других ферментных препаратов показали обратное: активность карбоксиметилцеллюлазы и ксиланазы осталась на прежнем уровне после 6 часов в рубцовой жидкости (Hristov et al., 1998b). Более того, под влиянием экзогенных ферментов активность ксиланазы и целлюлазы в рубце усилилась (Hristov et al., 1998a,b,1999). По некоторым данным уменьшение активности экзогенных ферментов в рубцовой жидкости связано как с их инактивацией, так и перемещение ферментов вместе с жидким содержимым рубца далее по пищеварительному тракту (рис. 4; Hristov et al., 1996b).

Тот факт, что экзогенные ферменты остаются активными в рубце, повышает вероятность их благотворного влияния за счет прямого гидролиза поступившего корма. Несколько исследований, проведенных как методом in vitro (Forwood et al., 1990; Varel et al., 1993; Hristov et al., 1996a; Feng et al., 1996; Dong et al., 1999), так и in situ (Lewis et al., 1996), свидетельствуют о том, что экзогенные ферменты могут улучшить расщепление клетчатки микроорганизмами рубца. Этот факт подтверждается в некоторых (Beauchemin et al., 1998a; Yang et al., 1998a), но не во всех (Firkins et al., 1990; Varel and Kreikemeier, 1994) исследованиях КРС с использованием рубцовых и дуоденальных фистул. Даже учитывая то, что экзогенные ферменты способны усилить активность ксиланазы и целлюлазы в рубцовой жидкости, ферментная активность в жидкости обычно не превышает 30% от всей активности в рубце, т.е. остальное действие ферментов связано с частицами корма (Minato et al., 1966; Brock et al., 1982). Например, при добавлении фибринолитических ферментов в рацион овец, состоящий из травяного сена, повысилась активность эндоглюканазы и ксиланазы в рубцовой жидкости, но в целом это соответствовало всего 0,5% от общей активности эндоглюканазы в рубце (табл. 3; Dong, 1998). Принимая во внимание то, что к экзогенным ферментам относится лишь небольшая часть ферментной активности в рубце, и то, что микрофлора рубца изначально способна к перевариванию клетчатки (McAllister et al., 1994), сложно представить себе, каким образом экзогенные ферменты могут усилить этот процесс путем прямого гидролиза.

Синергетическое взаимодействие с микроорганизмами рубца: Можно предположить, что улучшение переваривания клетчатки в рубце обусловлено взаимодействием ферментных препаратов с микроорганизмами рубца. Логически это означает, что действие препаратов с экзогенными ферментами ограничено перевариванием стенок растительной клетки, как и у микроорганизмов рубца в обычных условиях. Такая ограниченность действия может быть связана с нехваткой количества или видов ферментов, продуцируемых микроорганизмами рубца, с неспособностью деструктивных ферментов взаимодействовать с нужными веществами или с неподходящими для ферментной активности условиями в рубце (например, при низком уровне pH). Было выявлено не менее 21 вида ферментов, участвующих в гидролизе структурных полисахаридов, которые входят в состав стенок растительной клетки. Если микрофлора рубца не нарушена, все эти ферменты обычно образуются с ее помощью (White et al., 1993). В ходе исследований было доказано, что экстракт ферментов гриба Aspergillus oryzae позволяет увеличить количество микроорганизмов рубца (Newbold et al., 1992a,b) и может синергетически взаимодействовать с выделяемыми ими ферментами, активизируя высвобождение растворимых сахаров из сена (Newbold, 1995). Было определено, что образование поперечных связей паракумароильной и ферулоильной группы с арабиноксиланами является фактором, ограничивающим переваривание стенок растительной клетки (Hatfield, 1993). Было показано, что грибы Aspergillus oryzae могут формировать эстеразу, способную расщеплять сложноэфирные связи кислот паракумароильной и ферулоильной группы с арабиноксиланами (Tenkanen et al., 1991), в чем предположительно и заключается синергическое взаимодействие с микроорганизмами рубца (Varel et al., 1993). Однако многие присутствующие в рубце грибы (напр., Neocallimastix spp., Borneman et al., 1990) и бактерии (напр., Fibrobacter succinogenes, McDermid et al., 1990; и Butyrivibrio fibrisolvens, Dalrymple et al., 1996) образуют эстеразу, способную гидролизовать связи с фенольными кислотами. Тот факт, что экзогенные ферменты повышают только скорость, но не степень переваривания (Varel et al., 1993; Feng et al., 1996; Hristov et al., 1996a), говорит о том, что действие препаратов на их основе не отличается от процессов, происходящих внутри рубца. Недавнее исследование, в ходе которого образцы олигонуклеотидов 16S рРНК использовались для изучения среды рубца, дало основание полагать, что в рубце могут существовать фибролитические бактерии (напр., клостридии и руминококки), культуры которых еще только предстоит вырастить в лаборатории (Forster and Whitford, 1998). Если предположение окажется верным, такие микроорганизмы смогут дополнить широкий спектр действия ферментов, необходимых для эффективного переваривания стенок растительной клетки.

Гидролиз целлюлозы и гемицеллюлозы осуществляется либо свободными ферментами, либо целлюлосомными структурами, входящими в ряд ферментов, соединенных нековалентными связями в структурированный комплекс (Teeri, 1997). Аэробные грибы, основной источник экзогенных ферментов для рынка, гидролизуют стенки растительных клеток с помощью свободных ферментов, в то время как бактерии Clostridium spp. и анаэробные грибки рубца используют для этого целлюлосомные структуры (Beguin et al., 1998; Ljungdahl et al., 1998). Также доказано, что для расщепления клетчатки руминококки могут использовать целлюлосомные мультиферментные комплексы (Flint et al., 1998; Ohara et al., 1998). Разрушение мультиферментных комплексов во время экстракции ферментов объясняет, почему ферменты микроорганизмов рубца не могут извлечь из сена и соломы столько же растворимых сахаров, сколько извлекается экстрактом гриба A. oryze (Newbold, 1995).

Также получены доказательства того, что целлюлосомы могут участвовать в микробиальной адгезии клеток к их субстратам (Pell and Schofield, 1993; Beguin et al., 1998). Процесс адгезии крайне важен для эффективного переваривания фуража или зерновых кормов в рубце (McAllister et al., 1994; 1996). В присоединении бактерий рубца к целлюлозе могут участвовать целлюлозосвязывающие домены (Pell and Schofield, 1993). Сведения о том, что экзогенные ферменты блокируют или выявляют дополнительные участки микробиальной адгезии на поверхности кормов, на сегодняшний день отсутствуют. Введение водного раствора смеси фибролитических ферментов (3,3% об.) через фистулу в рубец овцы ухудшило переваривание сухого вещества (McAllister et al., 1998). Те же результаты были получены при аналогичном введении ферментов в рубец бычков мясного направления (Lewis et al., 1996). Эти исследования показали, что при введении в рубец ферменты не так эффективны, как при добавлении в корм. В некоторых случаях эффективность может зависеть от типа ферментов, так как введение других ферментов в рубец не повлияло на переваривание сухого вещества (Hristov et al., 1999). Нанесение экзогенных ферментов на прессованную люцерну до скармливания животным усилило формирование бактериальных колоний, а также убыль in situ сухого вещества фуражного корма за период от 3 до 24 часов инкубации в рубце (Yang et al., 1998a). Данный эффект был также подтвержден ростом числового показателя переваримости клетчатки в рубце и его существенным ростом во всем ЖКТ (Yang et al., 1998a).

Поскольку высококонцентрированные рационы содержат мало клетчатки, удивителен тот факт, что фибролитические ферменты улучшили переваривание корма (Krause et al., 1998) и продуктивность животных, получавших корма с высоким содержанием злакового зерна (Beauchemin et al., 1997; Iwassa et al., 1997). Объяснить этот феномен поможет сопоставление оптимального значения рН фибролитических ферментов, образованных микроорганизмами рубца, и экзогенных ферментов, образованных аэробными грибами. Документально доказано, что рН менее 6,2 затормаживает размножение фибролитических бактерий (Russell and Dombrowski, 1980) и сильно затрудняет переваривание клетчатки (Hoover et al., 1984). Большинство фибролитических ферментов, образованных микроорганизмами рубца, работают оптимально при рН выше 6,2 (Greve et al., 1984; Matte and Forsberg, 1992). В отличие от них, для фибролитических ферментов, образованных аэробными грибами, оптимальное значение рН составляет от 4,0 до 6,0 (Gashe, 1992; Muzakhar et al., 1998). Этот факт наглядно подтверждается результатами исследования, в ходе которого образование газа ферментами гриба Trichoderma longibrachiatum усиливалось прямо пропорционально уменьшению pH с 6,5 до 5,5 (табл. 4; Morgavi et al., неопубликованные данные). Несмотря на то, что при снижении рН с 6,5 до 5,5 культуры рубца в сочетании с ферментами гриба T. longibrachiatum, хуже переваривали сухое вещество из корма на основе кукурузного силоса, отсутствие дополнительных ферментов делает негативное влияние низкого рН на переваривание сухого вещества еще более заметным (табл. 4). Большую часть суток значение pH в рубце молочного скота (Nocek, 1998; Yang et al., 1998a) и мясного скота на откорме (Krause et al., 1998) может оставаться ниже 6,0. При таких условиях экзогенные ферменты могли бы существенно улучшить переваривание клетчатки в рубце. Тот факт, что экзогенные ферменты увеличили конверсию корма у откормочного скота, получавшего ячмень, и никак не повлияли на тот же показатель у животных с кукурузой в рационе, объясняется более высоким в отличие от кукурузы содержанием клетчатки в ячмене (Beauchemin et al., 1997).

Существуют некоторые доказательства того, что неочищенные экстракты ферментов могут синергетически взаимодействовать с микроорганизмами рубца за счет факторов неферментного характера. В ходе первых экспериментов с целлюлазой грибкового происхождения было установлено, что нагревание ее экстракта в течение 20 минут не снижает влияния фермента на переваривание целлюлозы in vitro (Bowden and Church, 1959). Это исследование показало, что добавление валина или пролина к инкубационной среде улучшало переваривание целлюлозы в той же степени, что и добавление целлюлазы. Более позднее исследование показало, что после выдержки в автоклаве экстракт A. oryzae (8% об.) улучшил расщепление клеточных стенок in vitro (Varel et al., 1993). Исследователи объяснили полученный результат наличием в экстракте растворимого субстрата, но отметили, что результат мог бы быть другим при использовании экстракта в концентрации, рекомендуемой для in vivo (т.е. 0,067 мг/мл). Воздействие факторов неферментного характера заметнее в опытах in vitro чем in vivo, поскольку микробиальные популяции проявляют меньшую способность к адаптации in vitro. При этом концентрация добавки выше из-за отсутствия движения и растворения корма. Зачастую экстракты ферментов содержат консерванты, продлевающие их срок годности, а также эмульгаторы (напр., ПАВ), которые сохраняют ферменты в виде суспензии и способствуют нанесению препарата на корм. Лабораторные исследования показали, что ПАВ могут влиять на микробиальную активность и расщепление корма в рубце (McAllister et al., 1999). К сожалению, мало кто из производителей ферментов указывает неферментные компоненты в составе препарата, поэтому трудности в разграничении неферментного и ферментного действия препаратов по-прежнему не позволяют определить механизм действия этих препаратов.

Прохождение содержимого по рубцу: Исследования показывают, что ферменты могут как ускорять прохождение содержимого по рубцу (Feng et al., 1996; Dong, 1998), так и не оказывать на него никакого влияния (Beauchemin et al., 1998a; Yang et al., 1998a). Повышение проходимости можно объяснить более быстрым уменьшением размера частиц в рубце и соответствующим увеличением объема потребляемого корма (Mertens et al., 1984). Несмотря на то, что в некоторых экспериментах экзогенные энзимы улучшили как потребление, так и переваривание корма (Stokes and Zheng, 1995; Sanchez et al., 1996), в других случаях улучшение переваривания не сопровождалось ростом потребления корма или ускорением прохождения содержимого по рубцу (Judkins and Stobart, 1988; Beauchemin et al., 1998a; Krause et al., 1998; Kung et al., 1998). Такие исследования дают основание полагать, что действие экзогенных ферментов частично проявляется в послерубцовом участке ЖКТ.

Послерубцовое действие

Лабораторные исследования показали, что экзогенные ферменты повышают фибролитическую активность не только в рубце, но еще и в тонком кишечнике (Hristov et al., 1998a,b,1999). Особенно отчетливо это видно на примере ксиланазы. Ферментные добавки увеличивают активность ксиланазы в двенадцатиперстной кишке на 30% (Hristov et al., 1998a). В ходе того же исследования активность целлюлазы в тонком кишечнике выросла всего лишь на 2–5% из-за того, что ферменты препарата была по большей части инактивированы низким рН и пепсином в сычуге. По данным других исследований, ксиланаза мизофилов и термофилов устойчива к протеолизу (Fontes et al., 1995), предположительно из-за высокой степени гликолизирования (Gorbacheva and Rodionova, 1977). Однако наши исследования установили, что главной причиной инактивации ксиланазы в сычуге был не пепсин, а уровень кислотности (Hristov et al., 1998a). При значении pH от 2,0 до 2,6 (Sturkie, 1970) содержимое мускульного желудка домашней птицы становится менее кислым и задерживается в желудке меньше времени, чем содержимое желудка свиней или рубца жвачных. Разница в физиологии ЖКТ помогает объяснить, почему улучшения продуктивности при использовании ферментных добавок у домашней птицы происходят стабильней, чем в случае со свиньями или жвачными (Campbell and Bedford, 1992; Baas and Thacker, 1996).

Введение большого количества ферментов (400 г/д) непосредственно в рубец может существенно повысить активность целлюлазы в малом кишечнике (Hristov et al., 1999). Вводимые таким образом экзогенные ферменты попадают в жидкую фазу содержимого рубца (Hristov et al., 1999), а повышенная дозировка помогает целлюлазе частично сохранить активность, даже несмотря на воздействие низкого рН и пепсина в сычуге. Наблюдения показывают, что активность ксиланазы в малом кишечнике повышается при уменьшении вязкости содержимого кишечника (табл. 5; Hristov et al., 1998b, 1999). Поскольку содержимое двенадцатиперстной кишки становится более вязким под действием кормов, состоящих преимущественно из зерна (Mir et al., 1998), снижение вязкости за счет ферментов могло бы улучшить усвоение питательных веществ в тонком кишечнике скота, получающего зерновой рацион. При внесении ферментов в корм или непосредственно в сычуг животных общая переваримость сухого вещества в ЖКТ повысилась благодаря меньшей вязкости содержимого на 1,2% и 1,5% соответственно (Hristov et al., 1998a). Однако вязкость содержимого кишечника у жвачных составляет всего лишь 1–2 сП (Mir et al., 1998), в то время как у домашней птицы ее значение может превышать 400 сП (Bedford, 1993). Ускорение роста домашней птицы за счет добавления в корм ферментов часто сопровождается 10-кратным сокращением вязкости содержимого кишечника (Bedford, 1993; Graham, 1996). Таким образом, трудно определить взаимосвязь между небольшим снижением вязкости кишечника жвачных, получающих с кормом высокую дозу ферментов, и заметным улучшением усвоения питательных веществ в малом кишечнике.

В исследованиях, объектом которых выступали молочные коровы с рационом на основе ячменного зерна, улучшение общей переваримости корма в ЖКТ приписывали в основном повышенной переваримости клетчатки и крахмала в его нижнем отделе (Beauchemin et al., 1998a). Гидролиз сложных углеводов, осуществляемый экзогенными ферментами в малом кишечнике, и последующее усвоение выделенных сахаров могли бы улучшить энергетический и азотный баланс животного. Ни энергия, ни азот не были бы доступны организму, если бы указанные субстраты остались непереваренными или подверглись бы ферментации микробиальными культурами в толстой кишке. Вполне возможно, что экзогенные ферменты могут синергетически взаимодействовать с микроорганизмами даже в толстой кишке, если учесть, что по результатам анализа экскрементов активность ксиланазы растет линейно с увеличением количества добавляемых ферментов (табл. 5; Hristov et al., 1999). Такое повышение фибролитической активности может оказать существенное влияние на скорость разложения экскрементов в окружающей среде.

Повышение эффективности использования экзогенных ферментов в кормлении жвачных

Подбор ферментов, соответствующих корму

Не все экзогенные ферменты одинаково эффективны в переваривании сложных субстратов, таких как люцерна и ячменное зерно (табл. 6). Структура кормов становится все более сложной, и отсутствие знаний о факторах, ограничивающих скорость и степень переваривания корма, тормозит разработку ферментных препаратов, способных справиться с такими ограничениями. В отношении некоторых кормов мы можем назвать задачи, стоящие перед исследователями. У кукурузы, например, белковая матрица, которая окружает крахмальные зерна, (в отличие от свойств самого крахмала) определяет степень и скорость переваривания крахмала в таком зерне (McAllister et al., 1993). Таким образом, экзогенные ферменты, предназначенные для улучшения усвоения кукурузы, должны содержать протеазы, способные переварить белковую матрицу и обнажить крахмальные зерна для их последующего переваривания эндогенными ферментами микроорганизмов рубца или организма хозяина. Препарат с экзогенными ферментами, содержащий амилазу, а не протеазу, не сможет повысить усвоение кукурузы жвачными. В соломе основными препятствиями для микробиального переваривания являются диоксид кремний, воск и кутин (Bae et al., 1997), а степень переваривания необработанного зерна зависит от перикарпия (Wang et al., 1998). Ферментные препараты, переваривающие структурные компоненты, которые ограничивают переваримость корма в рубце, могут оказаться более эффективными, чем добавки, которые просто ускоряют расщепление корма в рубце. Несмотря на широкое применение многих ферментных препаратов, попытки определить типы и состав входящих в них ферментов так и не были предприняты. Произвольное комбинирование ферментов и кормов без учета специфики конкретных субстратов только задержит тот момент, когда применение экзогенных ферментов станет нормальной практикой в отрасли животноводства. Наконец, разработка смесей ферментов должна быть направлена на преодоление ограничений переваримости конкретного корма. Ферментный состав таких смесей может варьироваться даже определенного фуражного корма – в зависимости от зрелости ингредиентов и структурных особенностей. Благодаря новейшим биотехнологиям стало возможным создавать подобные ферментные смеси, содержащие ксиланазу и β-глюканазу. Однако до сих пор отсутствует технология, которая позволила бы производить множество других потенциально важных, ориентированных на конкретные корма ферментов (напр., кутиназу, эстеразу феруловой кислоты, ацетилксилан-эстеразу, арабинофуранозидазу).

Снижение себестоимости ферментов

После определения механизмов действия экзогенных ферментов и ограничений в переваримости кормов, которые они должны преодолевать, можно перейти к оптимизации применения таких препаратов. Используемую дозировку препаратов можно сократить, если обеспечить наличие в их составе ферментов, которые гарантированно улучшат усвояемость кормов. В некоторых случаях активность препаратов из неочищенных ферментов можно повысить за счет включения в их состав отдельных ферментов, способных справиться с факторами, ограничивающими переваримость корма. В последнее время благодаря применению технологии рекомбинантных ДНК (генной инженерии) производители смогли повысить объем выпуска и эффективность ферментов, а также создать новые препараты (Ward and Conneely, 1993; Hodgson, 1994). Гены, отвечающие за выработку высокоэффективных ферментов, можно переносить из анаэробных бактерий и грибков, которые не подходят для производства ферментов в промышленном масштабе, в более пригодные для этого организмы-источники (напр., аспергиллы и сенная палочка). Экспрессия генов, отвечающих за выработку новых ферментов у растений, таких как канола и картофель, может стать весьма эффективным способом снижения себестоимости ферментов (Pen et al., 1993; van Rooijen and Moloney, 1994). В научном центре г. Летбридж ген β-глюканазы, полученный от рубцовой бактерии Fibrobacter succinogenes, экспрессировали в несколько линий картофеля, но при этом у разных линий наблюдалась 10-кратная разница в уровнях экспрессии гена (табл. 7). Теперь линию с самым высоким уровнем экспрессии гена оценивают на пригодность для кормления домашней птицы. Возможно, подобные технологии (напр., травы, экспрессирующие кутиназу и эстеразу) найдут свое применение и в области выращивания жвачных животных.

Выводы

В последние годы существенно выросло число ферментов, используемых в кормлении животных с однокамерным желудком, и ферментных препаратов, представленных на рынке. Во многих случаях механизмы действия этих препаратов были определены и описаны. Однако препараты на основе экзогенных ферментов, которые могли бы использоваться для кормления жвачных, весьма малочисленны, и большинство их появилось на рынке только недавно. Положительное влияние экзогенных ферментов на продуктивность жвачных было доказано, но полученные результаты сильно варьируются. Определение механизмов действия этих ферментов на жвачных затрудняется особенностью пищеварения животных (напр., наличием сложных микробиальных культур, вырабатывающих множество эндогенных ферментов). Доказано, что экзогенные ферменты активируют расщепление кормов до его попадания в организм животного, улучшая их последующее переваривание в рубце и нижнем отделе ЖКТ. Стоящая перед исследователями задача состоит в определении механизмов (независимого или взаимоусиливающего) действия экзогенных ферментов для улучшения конверсии корма, набора веса и рост, а также выработку молока у животных.

ТАБЛИЦА 1. Сравнение целлюлазной активности трех представленных на рынке ферментных препаратов

z Независимо от вида субстрата активность фермента определялась по выходу редуцирущих сахаров (нмоль) на 1 мг препарата в мин при 3-часовой инкубации субстрата и ферментного препарата в 0,2 М буферного раствора фосфата натрия с pH 6,0 при 39°С.

y Микрокристаллическая целлюлоза

x Карбоксиметилцеллюлоза

(адаптация данных из Hristov et al., 1996b)

ТАБЛИЦА 2. Потребление сухого вещества, выработка и состав молока у лактирующих коров с ферментами в рационе

a,b Отличия средних значений с разным верхним индексом в ряду статистически достоверны (P < 0,05).

z МД = добавка малой дозы ферментов к прессованному сену люцерны; ВД = добавка большой дозы ферментов к прессованному сену люцерны; КД = добавка ферментов к прессованному сену люцерны и концентрату.

ТАБЛИЦА 3. Влияние экзогенных ферментов на активность эндоглюканазы и ксиланазыz в рубце овец с травяным сеном в рационе

a,b Отличия средних значений с разным верхним индексом в ряду статистически достоверны (P < 0,05).

zАктивность эндоглюканазы стандартизировалась по ферментам из Penicillum funiculosm (коммерческий препарат EC 3.2.1.4 производства Sigma Chemical Co., г. Сент-Луис, штат Миссури, США), а ксиланазы – по ферментам из Aspergillus niger (коммерческий препарат EC3.2.18 того же производителя). Инкубация проводилась 30 мин в буферном растворе натрия фосфата с pH 6,5 при 39°С (адаптированные данные Dong, 1998).

ТАБЛИЦА 4. Влияние уровня pH и препаратов на основе ферментов Trichoderma longibrachiatum на образование газа и убыль сухого вещества кукурузного силоса в течение 48 часов инкубации с культурами бактерий рубца in vitroz

a,b Отличия средних значений с разным верхним индексом в ряду статистически достоверны (P < 0,05).

z Для адаптации культур бактерий рубца к каждому из уровней рН до инкубации использовалась технология периодического культивирования. (Morgavi et al., неопубликованные данные).

ТАБЛИЦА 5. Действие ферментовz в содержимом двенадцатиперстной кишки и экскрементах животных при добавлении в рацион ферментов и без них

z Выражается как выход редуцирующих сахаров в нмоль на 1 мл в минуту.

y EF = ввод ферментов в корм; EA = ввод ферментов в сычуг (адаптация данных из Hristov et al., 1998).

x Ввод ферментов в рубец в дозировке 0 (для контр. группы) и в дозировке 100, 200 и 400 г/день (EFL (малая доза), EFM (средняя доза) и EFH (высокая доза) соответственно) (адаптация данных из Hristov et al., 1999).

w Линейный эффект от добавки ферментов (P < 0,001).

a,b Отличия средних значений с разным верхним индексом в ряду и в рамках опыта статистически достоверны (P < 0,05).

A,B Отличия средних значений с разным верхним индексом в ряду и в рамках опыта статистически достоверны (P < 0,10).

ТАБЛИЦА 6. Выход редуцирущих сахаровz из сена люцерны и лущеного ячменя в зависимости от используемого ферментного препарата

z Выражается в миллионных долях глюкозы, полученной из продукта (при 0,250 мг/мл) в типовых экспериментальных условиях.

ТАБЛИЦА 7. Накопление глюканазы в листьях и клубняхz семи трансгенных линий картофеля (Solanum tuberosum)

zβ-глюканазу из Fibrobacter succinogenes экспрессировали в картофеле с помощью 35S промотора вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК) (Armstrong et al., 1999).

 Механизмы действия ферментов

В рубце:

Список литературы

Baas, T. C. and Thacker, P. A. (1996) Impact of gastric pH on dietary enzyme activity and survivability in swine fed p-glucanase supplemented diets. Canadian Journal of Animal Science 76, 245-252.

Bae, H. D., McAllister, T. A., Kokko, E. G., Leggett, F. L, Yanke, L. J., Jakober, K. D., Ha, J. K., Shin, H.T. and Cheng, K.-J. (1997) Effect of silica on the colonization of rice straw by ruminal bacteria. Animal Feed Science and Technology 65, 165-181.

Beauchemin, K. A., Rode, L. M. and Sewalt, V. J. H. (1995) Fibrolytic enzymes increase fiber digestibility and growth rate of steers fed dry forages. Canadian Journal of Animal Science 75, 641-644.

Beauchemin, K. A.. and Rode, L. M. (1996) Use of feed enzymes in ruminant nutrition. In: Rode, L.M. (ed.) Animal Science Research and Development-Meeting Future Challenges. Minister of Supply and Services Canada, Ottawa, ON, pp. 103-131

Beauchemin, K. A., Jones, S. D. M., Rode, L. M. and Sewalt, V. J. H. (1997) Effects of fibrolytic enzyme in corn or barley diets on performance and carcass characteristics of feedlot cattle. Canadian Journal of Animal Science 77, 645-653.

Beauchemin, K. A., Rode, L. M., Yang, Z. and McAllister, T. A. (1998b) Use of feed enzymes in ruminant nutrition. Proceedings of the 33rd Pacific Northwest Nutrition Conference. Vancouver, British Columbia, pp. 121-135.

Beauchemin, K. A., Yang, W. Z. and Rode, L. M. (1998a) Effects of enzyme additive or grain source on site and extent of nutrient digestion in dairy cows. Journal of Dairy Science (in press).

Bedford, M. R. (1993) Mode of action of feed enzymes. Journal of Applied Poultry Research 2, 85-92.

Beguin, P., Chauvaux, S., Guglielmi, G., Matuschek, M., Leibovitz, E., Chaveroche, M.-K., Miras, I., Alzari, P. and Gounon, P. (1998) The Clostridium thermocellum cellulosome: organization and mode of attachment to the cell. MIE Bioforum, Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation. Suzuka, Japan, p. 107.

Biely, P., Mislovicova, D. and Toman, R. (1985) Soluble chromogenic substrates for the assay of endo- 1,4-p-xylanases and endo-1,4-p-glucanases. Analytical Biochemistry 144, 142-146.

Borneman, W. S., Hartley, R. D., Morrison, W. H., Akin, D. E. and Ljundahl, L. G. (1990) Feruloyl and p- coumaroyl esterase from anaerobic fungi in relation to plant cell wall degradation. Applied Microbiology and Biotechnology 33, 345-351.

Bowden, D. W. and Church, D. C. (1959) Effect of several enzyme concentrates on cellulose digestion in the artificial rumen. Journal of Animal Science 18, 1523.

Boyles, D. W., Richardson, C. R., Robinson, K. D. and Cobb, C. W. (1992) Feedlot performance of steers fed steam-flaked grain sorghum with added enzymes. Proceedings Western Section American Society of Animal Science. Fort Collins, Colorado, 43, 502-505.

Brock, F. M., Forsberg, C. W., and Buchanan-Smith, J. G. (1982) Proteolytic activity of rumen microorganisms and effects of proteinase inhibitors. Applied Environmental Microbiology 44, 561-569.

Burroughs, W., Woods, W., Ewing, S. A., Greig, J. and Theurer, B. (1960) Enzyme additions to fattening cattle rations. Journal of Animal Science 19, 458-464.

Campbell, G. L. and Bedford, M. R. (1992) Enzyme applications for monogastric feeds. A review. Canadian Journal of Animal Science 72, 449-466.

Chen, K. H., Huber, J. T., Simas, J., Theurer, C. B., Yu, P., Chan, S. C., Santos, F., Wu, Z. and Swingle, R. S. (1995) Effect of enzyme treatment or steam-flaking of sorghum grain on lactation and digestion in dairy cows. Journal of Dairy Science 78, 1721-1727.

Clark, J. D., Dyer, I. A. and Templeton, J. A. (1961) Some nutritional and physiological effects of enzymes for fattening cattle. Journal of Animal Science 20, 928.

Classen, H. L., Graham, H., Inborr, J. and Bedford, M. R. (1991) Growing interest in feed enzymes to lead to new products. Feedstuffs 63, 22-24.

Considine, P. J and Coughlan, M. P. (1989) Production of carbohydrate-hydrolyzing enzyme blends by solid-state fermentation. In: Coughlan, M. P. (ed.) Enzyme Systems for Lignocellulose Degradation. Elsevier Applied Science, New York, pp. 273-281.

Dalrymple, B. P., Swadling, Y., Cybinski, D. H. and Xue, G. P. (1996) Cloning of a gene encoding cinnamoyl ester hydrolase from the ruminal bacterium Butyrivibrio fibrisolvens E14 by a novel method. FEMS Microbiology Letters 143, 115-120.

Dong, Y. 1998. Reducing methane emissions from ruminant animals. Ph. D. Dissertation, University of Alberta, Edmonton, Alberta.

Dong, Y., Bae, H. D., McAllister, T. A., Mathison, G. W. and Cheng, K.-J. (1999) The effect of exogenous fibrolytic enzymes, a-bromoethanesulfonate and monensin on digestibility of grass hay ans methane production in the Rusitec. Canadian Journal of Animal Science (submitted).

Feng, P., Hunt, C. W., Pritchard, G. T. and Julien, W. E. (1996) Effect of enzyme preparations on in situ and in vitro degradation and in vivo digestive characteristics of mature cool-season grass forage in beef steers. Journal of Animal Science 74, 1349-1357.

Firkins, J. L., Weiss, W. P., Eastridge, M. L. and Hull, B. L. (1990) Effects of feeding fungal culture extract and animal-vegetable fat on degradation of hemicellulose and on ruminal bacterial growth in heifers. Journal of Dairy Science 73, 1812-1822.

Flint, H. J., Aurillia, V., Kirby, J., Miyazaki, K., McCrae, S. I., Rincon, M. T. and Martin, J. C. (1998) Organization of plant cell wall degrading enzymes in the ruminal anaerobic bacteria Ruminococcus flavefaciens and Prevotella bryantii. MIE Bioforum, Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation. Suzuka, Japan, p. 115.

Fontes, C. M. G. A., Hall, J., Hirst, B. H., Hazlewood, G. P. and Gilbert, H. J. (1995) The resistance of cellulases and xylanases to proteolytic inactivation. Applied Microbial Biotechnology 43, 52-57.

Forster, R. J. and Whitford, M. F. (1998) Investigations into rumen microbial diversity using molecular cloning and probing techniques. MIE Bioforum, Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation. Suzuka, Japan, p. 93.

Forwood, J. R., Sleper, D. A. and Henning, J. A. (1990) Topical cellulase application effects on tall fescue digestibility. Agronomy Journal 82, 900-913.

Gashe, B. A. (1992) Cellulase production and activity by Trichoderma sp. A-001. Journal of Applied Bacteriology 73, 79-82.

Gorbacheva, I.,and Rodionova, N. A. (1977) Studies on xylan degrading enzymes. I. Purification and characterization of endo-1,4-p-xylanase from Aspergillus niger str. 14. Biochemistry, Biophysics Acta 484, 79-93.

Graham, H. (1996) Feed enzymes influence intestinal microflora. Zootechnica International 19, 88-92.

Greve, L. C., Labavitch, J. M. and Hungate, R. E. (1984) a-L-Arabinofuranosidase from Ruminococcus albus 8: Purification and possible role in the hydrolysis of alfalfa cell wall. Applied and Environmental Microbiology 47, 1135-1140.

Gwayumba, W. and Christensen, D. A. (1997) The effect of fibrolytic enzymes on protein and carbohydrate degradation fractions in forages. Canadian Journal of Animal Science 77, 541-542.

Hatfield, R. D. (1993) Cell wall polysaccharide interactions and degradability. Phenolic constituents of plant cell walls and wall biodegradability. In: Jung, H. G., Buxton, D. R., Hatfield, R. D. and Ralph, J. (eds.) Forage Cell Wall Structure and Digestibility. American Society of Agronomy, Crop Science Society of America, Soil Science Society of America, Madison, Wisconsin, pp. 285-313.

Headon, D. R. (1993) Activity analysis of enzyme under field conditions. In: C. Wenk and M. Boessinger (eds.) Enzymes in Animal Nutrition, Proceedings of the 1st Symposium. Kartause, Switzerland, pp. 233­240.

Hill, K. J. (1970) Salivary and gastric secretions. In: Swenson, M. J. (ed.) Duke’s Physiology of Domestic Animals. Cornell University Press, New York, p. 385.

Hodgson, J. (1994) The changing bulk biocatalyst market. Bio/Technology 12, 789-790.

Hoover, W. H., Kincaid, C. R., Varga, G. A., Thayne, W. V. and Junkins, L. L. Jr. (1984) Effects of solids and liquid flows of fermentation in continuous cultures. IV. pH and dilution rates. Journal of Animal Science 58, 692-699.

Hristov, A. N., Rode, L. M., Beauchemin, K. A. and Wuerfel, R. L. (1996) Effect of a commercial enzyme preparation on barley silage in vitro and in sacco dry matter degradability. Proceedings, Western Section, American Society of Animal Science. Rapid City, South Dakota, 47, 282-284.

Hristov, A. N., McAllister, T. A. and Cheng, K.-J. (1996) Exogenous enzymes for ruminants. Proceedings of 17 th Western Nutrition Conference. Edmonton, Alberta, pp. 51- 61.

Hristov, A. N., McAllister, T. A. and Cheng, K.-J. (1998a) Stability of exogenous polysaccharide­degrading enzyme in the rumen. Animal Feed Science and Technology 76, 165-172.

Hristov, A. N., McAllister, T. A., Treacher, R. J. and Cheng, K.-J. (1998b) Effect of site of exogenous polysaccharide-degrading enzyme supplementation on rumen fermentation and nutrient digestibility. Journal of Animal Science (in press).

Hristov, A. N., McAllister, T. A. and Cheng, K.-J. (1999) Effect of increasing levels of fibrolytic enzymes on nutrient digestion in cattle fed barley grain diets. Journal of Animal Science (submitted).

Huhtanen, P. (1991) Associative effect of feeds in ruminants. Norwegian Journal of Agricultural Sciences Suppl. 5, 37-57.

Iwassa, A. D., Rode, L. M., Beauchemin, K. A. and Eivemark, S. (1997) Effect of fibrolytic enzymes in barley-based diets on performance of feedlot cattle and in vitro gas production. In: Evolution of the Rumen Microbial Ecosystem, Joint RRI-INRA Rumen Microbiology Symposium. Aberdeen, Scotland, Poster 39.

Iwaasa, A. D., Rode, L. M. and Beauchemin, K. A. (1998) Cumulative gas production of alfalfa forage treated with different cell wall-degrading enzymes. Journal of Dairy Science 81, Suppl. 1, 291.

Judkins, M. B. and Stobart, R. H. (1988) Influence of two levels of enzyme preparation on ruminal fermentation, particulate and fluid passage rate and cell wall digestion in wether lambs consuming either a 10% or 25% grain diet. Journal of Animal Science 66, 1010-1015.

Kercher, J. (1960) Value of diallylstilbesterol and Zymo-pabst enzyme preparation for fattening yearling steers. Journal of Animal Science 19, 966.

Kopency, J., Marounek, M. and Holub, K. (1987) Testing the suitability of the addition of Trichoderma viride cellulases to feed rations for ruminants. Zivocisna vyroba 32, 587-592.

Krause, M., Beauchemin, K. A., Rode, L. M., Farr, B. I. and Norgaard, P. (1998) Fibrolytic enzyme treatment of barley grain and source of forage in high grain diets fed to growing cattle. Journal of Animal Science 96, 1010-1015..

Krause, O. G., Richardson, R., and Cobb, C. O. (1989) Biological responses of steers and rats fed grains with an added microbial enzyme mixture. Journal of Animal Science 67, Suppl. 1,280.

Kung, L. Jr. (1996) Direct-fed microbial and enzyme feed additives. In: S. Muirhead (ed.) Direct-Fed Microbial, Enzyme and Forage Additive Compendium. The Miller Publishing Company, Minetonka, Minnesota, pp. 15-20.

Kung, L. Jr., Treacher, R. J. and Cohen, M. A. (1998) Enzyme-treated forages for lactating cows. Journal of Animal Science 76, Suppl. 1, 196.

Leatherwood, J. M., Mochrie, R. D. and Thomas, W. E. (1960) Some effects of a supplementary cellulase preparation on feed utilization by ruminants. Journal of Dairy Science 43, 1460-1464.

Lehninger, A. L. (1982) Principles of Biochemistry, Worth Publishers, Inc., New York, NY.

Lewis, G. E., Sanchez, W. K., Treacher, R., Hunt, C. W. and Pritchard, G. T. (1995) Effect of direct-fed fibrolytic enzymes on lactational performance of midlactation Holstein cows. Proceedings, Western Section, American Society of Animal Science. Lethbridge, Alberta, 46, 310-313.

Lewis, G. E., Hunt, C. W., Sanchez, W. K., Treacher, R., Pritchard, G. T. and Feng, P. (1996) Effect of direct-fed fibrolytic enzymes on the digestive characteristics of a forage-based diet fed to beef steers. Journal of Animal Science 74, 3020-3028.

Ljungdahl, L. G., Blum, D. L., Chen, H., He, Y., Kataeva, I., Li, X. and Ximenes, E. A. (1998) The cellulase/hemicellulase system of the anaerobic fungus Orpinomyces and aspects of further cellulase research. MIE Bioforum, Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation. Suzuka, Japan, p. 19.

Luchini, N. D., Broderick, G. A., Hefner, D. L., Derosa, R., Reynal, S.and Treacher, R. (1997) Production response to treating forage with fibrolytic enzymes prior to feeding to lactating cows. Journal of Dairy Science 80, Suppl. 1,262.

Matte, A. and Forsberg, C. W. (1992) Purification, characterization, and mode of action of endoxylanases 1 and 2 from Fibrobacter succinogenes S85. Applied and Environmental Microbiology 58, 157-168.

McAllister, T. A., Phillippe, R. C., Rode, L. M. and Cheng, K.-J. (1993) Effect of the protein matrix on the digestion of cereal grains by ruminal microorganisms. Journal of Animal Science 71,205-212.

McAllister, T. A., Bae, H. D., Jones, G. A. and Cheng, K.-J. (1994) Microbial attachment and feed digestion in the rumen. Journal of Animal Science 72, 3004-3018.

McAllister, T. A. and Cheng, K.-J. (1996) Microbial strategies in the ruminal digestion of cereal grains. Animal Feed Science and Technology 62, 29-36.

McAllister, T. A., Oosting, S. J., Popp, J. D., Mir, Z., Yanke, L. J., Hristov, A. N., Treacher, R. J and Cheng, K.-J. (1998) Effect of exogenous enzymes on digestibility of barley silage and growth performance of feedlot cattle. Canadian Journal of Animal Science (in press).

McAllister, T. A., Stanford, K., Bae, H. D., Treacher, R. J., Baah, J., Shelford, J. A. and Cheng, K.-J. (1999) Effect of surfactant and exogenous enzymes on digestibility, growth performance and carcass traits of lambs. Canadian Journal of Animal Science (submitted).

McDermid, K. P., McKenzie, C. R. and Forsberg, C. W. (1990) Esterase activities of Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes S85. Journal of Bacteriology 170, 2914-2922.

Mertens, D. R., Strawn, T. L. and Cardoza, R. (1984). Modelling ruminal particle size reduction: Its relationship to particle size description. In: Kennedy, P. M. (ed.) Techniques in particle size analysis of feed and digesta in ruminants. Canadian Society of Animal Science Publication No. 1., Edmonton, Alberta, pp. 134-141.

Michal, J. J., Johnson, K. A., Treacher, R. J., Gaskins, C. T. and Sears, O. (1996) The impact of direct fed fibrolytic enzymes on the growth rate and feed efficiency of growing beef steers and heifers. Journal of Animal Science 74, Suppl. 1,296.

Minato, H., Endo, A., Ootomo, Y. and Uemura, T. (1966) Ecological treatise on the rumen fermentation. II. The amylolytic and cellulolytic activities of fractionated bacterial portions attached to the rumen solids. Journal of General Applied Microbiology 12, 53-69.

Mir, P. S., Mears, G. J., Mir, Z. and Morgan Jones, S. D. (1998) Effects of increasing dietary grain on viscosity of duodenal digesta and plasma hormone and glucose concentrations in steers. Journal of Animal Science 76, Suppl. 1,247.

Muirhead, S. (1996) Direct Fed Microbial, Enzyme and Forage Additive Compendium, 3rd edn. The Miller Publishing Company, Minetonka, Minnesota, 391 pp.

Muzakhar, K., Hayashii, H., Kawaguchi, T., Sumitani, J. And Arai, M. (1998) Purification and properties of a-L-arabinofuranosidase and endo-p-D-1,4-galactanase from Aspergillus niger KF-267 which liquefied the okara. MIE Bioforum, Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation. Suzuka, Japan, p. 133.

Nelson, F. and Damon, V. (1960) Comparison of different supplemental enzymes with and without diethylstilbestrol for fattening steers. Journal of Animal Science 19, 1279.

Newbold, C. J., Brock, R. and Wallace, R. J. (1992) The effect of Aspergillus oryzae fermentation extract on the growth of fungi and ciliate protozoa in the rumen. Letters in Applied Microbiology 15, 109-112.

Newbold, C. J., Frumholtz, P. P. and Wallace, R. J. (1992b) Influence of Aspergillus oryzae fermentation extract on rumen fermentation and blood constituents in sheep given diets of grass hay and barley. Journal of Agricultural Science Cambridge 119, 423-427.

Newbold, C. J. (1995) Microbial feed additives for ruminants. In: Wallace, R. J. and Chesson, H. C. (eds.) Biotechnology in Animal Feeds and Animal Feeding. VCH Publishers Inc., New York, pp. 259-278.

Nocek, J. W. (1998) Carbohydrates in dairy rations: managing subclinical acidosis. Proceedings of the 33rd annual Pacific Northwest Animal Nutrition Conference, Vancouver, British Columbia, pp. 17-31.

Nussio, L. G., Huber, J. T., Theurer, C. B., Nussio, C. B., Santos, J., Tarazon, M., Lima-Filho, R. O., Riggs, B., Lamoreaux, M. and Treacher, R. J. (1997) Influence of a cellulase/xylanase complex (C/X) on lactational performance of dairy cows fed alfalfa hay based diets. Journal of Dairy Science 80, Suppl. 1, 220.

Ohara, H., Karita, S., Kimura, T., Sakka, K. and Ohmiya, K. (1998). Multicellulase complex of

Ruminococcus albus F40. MIE Bioforum, Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation. Suzuka, Japan, p. 140.

Pell, A. N. and Schofield, P. (1993) Microbial adhesion and degradtion of plant cell walls. In: Jung, H. G., Buxton, D. R., Hatfield, R. D. and Ralph, J. (eds.) Forage Cell Wall Structure and Digestibility. American Society of Agronomy, Crop Science Society of America, Soil Science Society of America, Madison, Wisconsin, pp. 397-423.

Pen, J., Verwoerd, T. C., van Paridon, P. A., Beudeker, R. F., van den Elzen, P. J. M., Geerse, K., van der Klis, J. D., Versteegh, H. A. J., van Ooyen, A. J. J. and Hoekema, A. (1993) Phytase-containing transgenic seeds as a novel feed additive for improved phosphorus utilization. Biotechnology 11,811­814.

Pendleton, B. (1996) The regulatory environment. In: Muirhead, S. (ed.) Direct-Fed Microbial, Enzyme and Forage Additive Compendium. The Miller Publishing Company, Minetonka, Minnesota, pp. 47-52.

Perry, T. W., Cope, D. D. and Beeson, W. M. (1960) Low vs high moisture shelled corn with and without enzymes and stilbestrol for fattening steers. Journal of Animal Science 19, 1284.

Perry, T. W., Purkhiser, E. D. and Beeson, W. M. (1966) Effects of supplemental enzyme on nitrogen balance, digestibility of energy and nutrients and on growth and feed efficiency of cattle. Journal of Animal Science 25, 760-764.

Pritchard, G., Hunt, C., Allen, A. and Treacher, R. (1996) Effect of direct-fed fibrolytic enzymes on digestion and growth performance in beef cattle. Journal of Animal Science 74, Suppl. 1,296.

Rovics, J. J. and Ely, C. M. (1962) Response of beef cattle to enzyme supplement. Journal of Animal Science 21,1012.

Russell, J. B. and Dombrowski, D. B. (1980) Effect of pH on the efficiency of growth by pure cultures of rumen bacteria in continuous culture. Applied and Environmental Microbiology 39, 606-610.

Rust, J. W., Jacobsen, N. L., McGilliard, A. D. and Hotchkiss, D. K. 1965. Supplementation of dairy calf diets with enzymes. II. Effect on nutrient utilization and on composition of rumen fluid. Journal of Animal Science 24, 156-160.

Sabatier, A. M. and Fish, N. M. (1996) Method of analysis for feed enzymes: methodological problems? Journal of Applied Poultry Research 5, 408-413.

Sanchez, W. K., Hunt, C. W., Guy, M. A., Pritchard, G. T., Swanson, B. I., Warner, T. B. and Higgins, J. M. (1996) Effect of fibrolytic enzymes on lactational performance of dairy cows. Journal of Dairy Science 79, Suppl. 1, 183.

Stokes, M. R. and Zheng, S. (1995) The use of carbohydrase enzymes as feed additives for early lactation cows. Proceedings of the 23rd Conference on Rumen Function. Chicago, Illinois, p. 34.

Sturkie, P. D. (1970) Avian digestion. In: Swenson, M. J. (ed.) Duke’s Physiology of Domestic Animals. Cornell University Press, New York, pp. 530-533.

Teeri, T. T. (1997) Crystalline cellulose degradation: new insight into the function of cellobiohydrolases. Trends in Biotechnology 15, 160-167.

Tenkanen, M., Schuseil, J., Puls, J. and Poutanen, K. (1991) Production, purification and characterization of an esterase liberating phenolic acids from lignocellulosics. Journal of Biotechnology 18, 69-84.

Theurer, B., Woods, W. and Burroughs, W. (1963) Influence of enzyme supplements in lamb fattening rations. Journal of Animal Science 22, 150-154.

van Rooijen, G. J. H. and Moloney, M. M. (1994) Plant seed oil-bodies as carriers for foreign proteins. Bio/Technology 13, 72-77.

Vandevoorde, L. and Verstraete, W. (1987) The effect of aerobic cellulases on rumen fermentation. Medical Faculty Landbouww Rijksuniversity Gent 52, 1647-1654.

Varel, V. H., Kreikemeier, K. K., Jung, H. G. and Hatfield, R. D. (1993) In vitro stimulation of forage fiber degradation by ruminal microorganisms with Aspergillus oryzae fermentation extract. Applied and Environmental Microbiology 59, 3171-3176.

Varel, V. H. and Kreikemeier, K. (1994) Influence of feeding Aspergillus oryzae fermentation extract (Amarferm) on the in situ fiber degradation, ruminal fermentation, and microbial protein synthesis in nonlactating cows fed alfalfa of bromegrass hay. Journal of Animal Science 72, 1814-1822.

Wang, Y., McAllister, T. A., Xu, Z. J., Gruber, M. Y., Skadhauge, B., Jende-Strid, B. and Cheng, K.-J. (1998) Effects of proanthocyanidins, dehulling and removal of pericarp on digestion of barley grain by ruminal microorganisms. Journal of the Science of Food and Agriculture (in press).

Ward, P. P. and Conneely, O. M. (1993) Using biotechnology to improve enzyme yields: From DNA to the marketplace. In: C. Wenk and M. Boessinger (eds.) Enzymes in Animal Nutrition, Proceedings of the 1st Symposium. Schriftenreihe aus dem Institut fur Nutztierwissenschaften Gruppe Ernahrung, Kartause Ittingen, Switzerland, pp. 16-21.

White, B. A., Mackie, R. I., and Doerner, K. C. (1993) Enzymatic hydrolysis of forage cell walls. In: Jung, H. G., Buxton, D. R., Hatfield, R. D. and Ralph, J. (eds.) Forage Cell Wall Structure and Digestibility. American Society of Agronomy, Crop Science Society of America, Soil Science Society of America, Madison, Wisconsin, pp. 455-484.

Wing, J. M., Van Horn, H. H., Sklare, S. D., and Harris, B. Jr. (1988) Effects of citrus molasses distillers solubles and molasses on rumen parameters and lactation. Journal of Dairy Science 71,414-420.

Weichenthal, B., Rush, I. and Van Pelt, B. (1996) An enzyme-microbial feed product for finishing steers. In: Nebraska Beef Cattle Report. University of Nebraska, Lincoln, Nebraska, pp. 68-69.

Yang, W. Z., Beauchemin, K. A. and Rode, L. M. (1998a) Effects of enzyme feed additives on extent of digestion and milk production of lactating dairy cows. Journal of Dairy Science (in press).

Yang, W. Z., Rode, L. M. and Beauchemin, K. A. (1998b) Effects of fibrolytic enzyme additives on milk production of dairy cows. Journal of Animal Science 76, Suppl. 1,320.Suppl. 1,320.